Ассистент по исследованиям TSRI Альберто Родригес использует крошечную микропипетку, похожую на соломинку, чтобы собирать красные флуоресцентные нейроны и переносить их геномы в яйцо.
В новом исследовании, опубликованном сегодня в журнале Neuron, ученые из Исследовательского института Скриппса (TSRI) первыми секвенировали полные геномы отдельных нейронов и получили живых мышей, несущих нейронные геномы во всех своих клетках.
Использование этого метода дало удивительную информацию о геномах этих клеток, в том числе о том, что каждый нейрон содержал в среднем более 100 мутаций и что эти нейроны накапливали больше мутаций в генах, которые они часто использовали.
"Геномы нейронов долгое время оставались загадкой," сказала доцент TSRI Кристин Болдуин, старший автор нового исследования и член Центра нейробиологии Дорриса в TSRI. "Результаты этого исследования и обширная проверка открытия мутаций на основе секвенирования генома, которое позволяет этот метод, открывают дверь для дополнительных исследований мутаций мозга при старении и болезнях, которые могут помочь нам понять или лечить снижение когнитивных функций при старении, нейродегенерации и заболевания нервной системы, такие как аутизм."
Уникальные мутации
Наши индивидуальные геномы унаследованы от родителей и делают нас уникальными по своему поведению, внешнему виду и восприимчивости к болезням. Хотя известно, что новые мутации в геномах отдельных клеток вызывают рак, только недавно исследователи начали понимать, насколько разными могут быть геномы в нормальных клетках организма. Несколько направлений исследований показали, что клетки мозга могут быть особенно уникальными и склонными к накоплению новых мутаций различного рода, в том числе "прыжки" гены, называемые транспозонами.
Многие из этих мутаций могут и не быть вредными, но сбор слишком большого количества мутаций или их накопление в генах, необходимых для функционирования клетки, может привести к потере нейронов или неправильному мозговому соединению, которые являются предполагаемыми причинами таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера и аутизм.
"Нам нужно больше знать о мутациях в головном мозге и о том, как они могут повлиять на функцию клеток," сказала научный сотрудник TSRI Дженнифер Хейзен, соавтор нового исследования с Грегори Фаустом из Медицинской школы Университета Вирджинии.
Однако изучение мутаций в отдельных нейронах представляет проблему: одна клетка не содержит достаточно генетического материала для анализа, но эти мутации существуют только в отдельных клетках. К сожалению, современные подходы к анализу отдельных клеток вносят новые ошибки ДНК, а также уничтожают единственную копию ДНК клетки в процессе, делая невозможным вернуться назад и проверить, действительно ли были мутации. Ученые не могут создавать копии нейронов, потому что, в отличие от других типов клеток, нейроны не делятся в культуре клеток.
"Не было простого способа получить больше копий нейрона," объяснил научный сотрудник TSRI Уильям Фергюсон, соавтор статьи.
Копии с помощью клонирования
Новое исследование помогает решить эту проблему. Команда взяла ядро нейрона мыши, в котором находится его ДНК, и вставила его в яйцеклетку, которая затем разделила и скопировала мутацию. Затем клонированные клетки превратились в тысячи или даже миллионы стволовых клеток с достаточным количеством ДНК для геномного анализа. Исследователи повторили процесс, чтобы создать несколько линий клонированных нейронов.
"Мы работали над тем, чтобы само яйцо скопировало геномы клеток мозга с помощью клонирования," сказал Болдуин.
"Мы обманываем нейрон, заставляя его думать, что это не нейрон," добавил Хазен. "Это дает нам возобновляемый источник копий этих геномов."
Чтобы подтвердить, что клонированные клетки действительно были нейронами, а не другими клетками мозга, исследователи пометили клетки яркими флуоресцентными маркерами. "Когда вы видите маркер, это вздыхает с облегчением – он сработал," сказал научный сотрудник TSRI Альберто Риос Родригес, соавтор исследования. Геномный анализ клонированных клеток предоставил дополнительные доказательства того, что уникальные мутации нейрона действительно передаются.
Впервые команда даже смогла создать клонированные нейроны линий стволовых клеток от мышей старше восьми недель. Это позволило исследователям увидеть мутации, которые накапливаются с течением времени. Еще более поразительно то, что некоторые из этих линий стволовых клеток могли быть выращены в фертильных взрослых мышах, которые были клонами одного нейрона мыши и несли нейронные мутации в каждой клетке поверх остальной ДНК исходной мыши.
Сергей Куприянов, директор ядра генетики мышей TSRI и соавтор исследования, назвал проект "технически сложный." Исследователи обнаружили, что не каждый мутировавший нейрон может быть превращен в линию стволовых клеток, хотя необходимы дополнительные исследования, чтобы объяснить, почему.
Однако линии стволовых клеток, которые действительно развились, предоставили некоторые удивительные идеи о мозге.
Последствия для нейронов человека
Исследователи обнаружили, что нейроны накапливают больше мутаций в используемых ими генах, что контрастирует с другими типами клеток, которые, кажется, защищают свои обычно используемые гены.
"Еще более удивительно," сказал Болдуин. "Мы обнаружили, что каждый нейрон, на который мы смотрели, был уникальным – он нес более 100 изменений ДНК или мутаций, которые не присутствовали в других клетках."
Исследователи не уверены, почему это разнообразие настолько распространено – нет никаких доказательств того, что нейроны перестраивают свою ДНК, как это делают клетки крови, – но Болдуин сказал, что если этот феномен сохранится у людей, наш мозг может содержать 100 миллиардов уникальных геномов.
Затем исследователи планируют использовать свою технику для изучения нейронных геномов очень старых мышей и мышей с неврологическими заболеваниями. Они надеются, что эта работа приведет к новым открытиям и терапевтическим стратегиям лечения старения мозга и неврологических заболеваний, вызванных мутациями нейронов.